와튼젤리란? 탯줄 조직에서
줄기세포를 분리하는 원리

와튼젤리의 정의와 제대 내 위치

와튼젤리(Wharton’s jelly, WJ)는 탯줄, 곧 제대(umbilical cord)의 혈관을 둘러싸는 점액결합조직이다. 젤라틴처럼 보이는 외관은 풍부한 수분과 세포외기질(extracellular matrix, ECM)에서 나온다. 세포외기질은 세포 밖에서 조직의 구조와 환경을 이루는 성분을 가리킨다. 정상적인 만삭 제대에는 대개 두 개의 제대동맥과 한 개의 제대정맥이 있고 바깥은 양막상피로 덮인다. 제대동맥은 태아에서 태반으로, 제대정맥은 태반에서 태아로 혈액을 운반한다. 동맥과 정맥의 이름은 산소의 많고 적음보다 심장에서 나가고 돌아오는 방향에 따른다.^[8]

그렇다면 와튼젤리는 줄기세포의 다른 이름일까. 여기서부터 대상이 갈라진다. 와튼젤리는 조직이고, 와튼젤리 유래 중간엽 기질세포(Wharton’s jelly-derived mesenchymal stromal cells, WJ-MSC)는 그 조직에서 분리·배양해 특성을 확인한 세포 집단이다. MSC의 S를 stem(줄기)으로 쓰는 논문과 stromal(기질)로 쓰는 논문은 같은 약자를 공유한다. 이 글은 줄기세포성이 별도로 입증되지 않은 배양 집단을 기질세포로 설명하고, 원 논문이나 제품이 사용한 줄기세포라는 명칭은 출처의 용어로 구별한다. 조직을 보았다는 사실과 그 안에서 어떤 세포를 얻었다는 사실 사이에는 분리와 검사가 놓여 있다. 이 글은 그 사이를 따라간다. 사진 속 조직에서 출발한 이름이 배양접시를 거쳐 병원의 주사 상품에 도착했을 때에도, 여전히 같은 대상을 가리키고 있는지 묻기 위해서다.^[1][4]

먼저 연구자들이 어디를 잘라냈는지부터 보자. 어떤 연구는 혈관 사이 기질을 좁게 WJ라 부르고 혈관주위 구획을 따로 떼며, 다른 연구는 더 넓은 점액결합조직을 WJ라고 부른다. 같은 이름을 썼는데도 출발 조직이 달라질 수 있는 셈이다. 제대 구획별 세포를 비교한 연구자 Arjunan Subramanian 등의 2015년 연구는 제대의 여러 구획을 따로 분리해 비교했다. 양막 아래, 혈관주위, 혈관 사이에서 얻은 집단을 구분해 놓으면, 단순히 “탯줄에서 얻었다”는 설명이 생략한 차이를 볼 수 있다. 따라서 제대 유래 중간엽 기질세포(umbilical cord-derived mesenchymal stromal cells, UC-MSC)라는 표기만 있는 논문은 아직 WJ-MSC로 좁혀 읽을 수 없다. 제대의 어느 부분을 사용했는지가 더 필요하다.^[1]

제대 조직사진의 해부 구획

단면 → 경계 → 혈관 → 기질

혈관의 빈 내강을 먼저 찾고 바깥 경계와 그 사이 조직을 구분한다. 아래 실제 도판의 a에서 전체 위치, c·d에서 확대 모습을 확인할 수 있다.

양막과 양막 아래 구획

도식의 바깥 선은 양막, 그 안쪽 띠는 양막 아래 구획을 단순화한 것이다. 실제 도판 c의 Amnion과 Sub-amnion을 대조한다.

혈관벽과 혈관주위 구획

도판 a의 Perivascular area와 b의 혈관벽을 본다. 내강의 혈액, 혈관벽, 혈관주위 조직은 같은 채취 재료가 아니다.

혈관 사이의 기질

도판 d에서는 분홍색 기질 사이에 세포가 흩어져 있다. 세포의 위치는 보이지만 줄기세포성은 이 사진만으로 판정하지 못한다.

자체 해부 개념도 · 실제 치수·혈관 배치·염색색을 재현한 그림이 아니다. 구획 표기는 아래 연구의 분류를 따른다. 근거 [1], [8].

도판 원본 확대 ↗

Subramanian·Fong·Biswas·Bongso, PLOS ONE (2015), Figure 1. 원 논문 · CC BY 4.0 · 원본 비율 유지, 이미지 내용 변경 없음.

A는 조직의 공간적 관계, B는 배양 결과다. 아래 그래프를 조직 안의 세포 밀도나 환자 치료효과로 읽지 않는다.

이 글의 도판은 그 연구의 Figure 1이다. 낮은 배율의 단면에서 먼저 혈관의 내강과 벽을 찾고, 바깥 경계의 양막을 확인한 다음, 그 사이를 채운 기질을 구별한다. 확대 사진 c의 Amnion은 표면의 양막, Sub-amnion은 그 아래 구획이며, d는 WJ 기질 안에 흩어진 세포를 보여준다. a에 표시된 Perivascular area와 b의 Adventitia는 혈관과 가까운 조직을 읽는 표지다. 현미경 사진의 분홍색과 보라색은 살아 있는 제대의 본래 색이 아니라 헤마톡실린·에오신(hematoxylin and eosin, H&E) 염색으로 구조를 구분한 결과다.^[1]

사진 d에는 hWJSCs라는 표기가 붙어 있다. 여기까지만 보면 현미경으로 줄기세포를 곧장 찾아낸 것처럼 보일 수 있다. 그러나 사진이 직접 보여주는 것은 세포의 위치와 형태다. 항원을 발현하는지, 증식한 뒤에도 관련 능력을 유지하는지는 이 염색사진에 찍혀 있지 않다. 연구자가 붙인 이름의 근거를 확인하려면 같은 논문의 분리·배양·특성 분석으로 이동해야 한다. 사진에 적힌 이름을 지우자는 것이 아니라, 그 이름을 붙일 수 있었던 검사를 함께 읽자는 뜻이다.^[1]

이 표에서 눈여겨볼 것은 같은 제대에서 출발해도 용기 안에 남는 것이 달라진다는 점이다. 조직을 담을 수도 있고, 배양한 세포를 담을 수도 있으며, 세포를 빼고 분비된 물질을 얻을 수도 있다. 나중에 임상시험을 읽을 때 다시 이 표로 돌아오게 된다. 효과가 있었다는 그 시험은, 이 가운데 무엇을 투여한 시험이었을까.^[4][30][31]

제대의 발생과 태아 순환에서의 기능

그 구획들은 처음부터 완성된 탯줄의 모습으로 놓여 있었던 것은 아니다. 제대는 발생 초기에 연결줄기와 배아를 태반 쪽에 이어 주는 구조들이 양막의 확장과 함께 정리되면서 형성된다. 연결줄기의 배외중배엽에서 점액결합조직이 발달하고, 발달 과정에는 요막과 난황관 관련 구조도 관여한다. 여기서 만삭 제대의 사진과 발생 도식을 대조하면 서로 다른 구조가 등장하는 이유를 알 수 있다. 하나는 형성 과정이고 다른 하나는 그 과정에서 일부 구조가 퇴축한 뒤의 단면이기 때문이다.^[8]

제대 혈관은 단순히 빈 관 세 개가 젤 속에 놓인 구조가 아니다. 혈관벽의 평활근, 혈관의 나선형 배치, 기질의 수분과 섬유망이 함께 압박과 비틀림에 대응한다. 임신 중 태아의 움직임으로 제대에는 여러 방향의 힘이 걸리며, 태아와 태반 사이 순환이 유지되려면 혈관 내강이 쉽게 무너지지 않아야 한다. 따라서 WJ의 생리적 역할을 이해하려면 세포의 수만 세기보다 하중을 받는 조직 전체를 보아야 한다.^[7]

혈관을 보호하는 원래 기능은 상품의 사용 목적과도 연결된다. 제대에서 혈관 주변을 지지하던 조직을 관절이나 다른 장기에 넣는 일이 원래와 같은 기능인지, 제조 중 그 기능이 유지되는지는 별도의 질문이다. “인체에 원래 있는 성분”이라는 설명은 기원의 설명이며, 특정 부위에 투여했을 때의 효과를 계산해 주지 않는다. 이 연결은 후반부에서 미국의 조직제품 규제를 읽을 때 다시 등장한다.^[40]

한편 태아 유래라는 설명에서 곧장 배아줄기세포를 떠올리면 발생 단계가 건너뛰어진다. 출산 후 제대에서 얻은 기질세포와 초기 배아의 다능성 세포는 같은 대상이 아니다. 조직이 얼마나 어린가, 어떤 세포로 분화할 수 있는가, 배양에서 얼마나 증식하는가는 각각 확인할 문제다. 태아 유래라는 사실은 첫 질문에 관한 정보를 주지만 나머지 둘까지 답하지는 않는다. 이제 그 조직 안으로 조금 더 들어가 보자. 혈관 주변의 부드러운 기질은 무엇으로 이루어져 있기에 압박을 받는 제대를 지지할 수 있을까.^[3][4]

수화된 기질과 콜라겐 섬유망의 물성

세포외기질(extracellular matrix, ECM)은 세포 사이를 채우는 수동적 빈 공간이 아니다. WJ에서는 콜라겐 섬유망과 히알루론산, 황산화 글리코사미노글리칸을 포함하는 성분들이 수분과 함께 조직의 역학적 성질을 만든다. 히알루론산은 글리코사미노글리칸이지만, 일반적인 황산화 GAG와 달리 황산화되지 않고 단백질 중심부에 공유결합한 전형적 프로테오글리칸 구조도 아니다. 성분 목록을 정확히 쓰려면 이 분류부터 나누어야 한다.^[5]

1983년 Meyer 등의 연구는 제대 기질을 효소로 처리해 팽윤이 어떻게 달라지는지 조사했다. 다당류를 제거하면 조직의 팽윤 경향이 사라졌고, 섬유성 망의 처리는 다른 부피 변화를 만들었다. 이런 실험의 의미는 “히알루론산이 있으니 보습한다”보다 구체적이다. 수분을 끌어들이는 성분과 그 팽창을 구속하는 섬유망 사이의 관계가 조직의 부피와 기계적 반응을 결정한다는 것이다. 분리해 낸 한 성분의 효능을 원래 조직 전체의 작용으로 대체할 수 없다.^[5]

성분 사이의 관계가 중요하다면, 이번에는 그 성분이 어떻게 배치되어 있는지가 궁금해진다. 1995년 Vizza 등의 주사전자현미경 연구는 콜라겐 망이 양막 쪽에서 혈관 쪽으로 이어지고, 내측과 외측에서 서로 다른 배열을 보인다고 기술했다. 겉으로는 비슷한 젤이어도 안쪽의 배열까지 균일하지는 않았던 것이다. 그렇다면 이 배열은 실제 힘을 받을 때 어떤 차이를 만들까. 2019년 Brunelli 등의 연구는 이축 인장시험과 유한요소 모형으로 구획별 역학 차이와 압박에 대한 힘의 분포를 조사했다. 두 연구를 연결하면 구조를 관찰하는 질문에서 그 구조가 힘을 전달하는 방식으로 나아갈 수 있다. 다만 여기까지 살핀 대상은 제대 조직의 물성이다. 가공해 주사한 제품의 환자 효과는 아직 이 실험 밖에 있다.^[6][7]

여기까지 보면 기질을 그저 세포를 꺼내고 버리는 포장재로 취급하기는 어렵다. 그렇다고 원래 조직의 성질이 가공 후에도 그대로 남는다고 할 수 있을까. 기질을 보존하려는 제품이라면 물성과 분해, 숙주세포의 침윤, 국소 염증과 조직 적합성을 살펴야 한다. 살아 있는 세포를 이용하려는 제품이라면 세포의 특성과 기능이 중심이 된다. 세포가 적다는 이유만으로 기질 연구를 무의미하다고 할 수도 없고, 기질이 있다는 이유로 세포치료의 근거를 빌려올 수도 없는 까닭이다. 같은 조직에서 출발했지만, 무엇을 남겨 무엇에 쓰려는지에 따라 연구의 질문은 벌써 갈라졌다.^[31]

해부학적 기록에서 배양 세포 연구까지

토머스 와튼(Thomas Wharton, 해부 연구를 수행한 영국 의사, 1614–1673)의 1656년 저서 Adenographia: sive glandularum totius corporis descriptio(인체의 샘을 기술한 해부학서)는 와튼젤리의 명칭을 추적하는 출발 자료다. Wellcome Collection은 해당 책의 서지와 디지털 소장본을 제공한다. 그러나 17세기 해부학자가 관찰한 젤라틴성 조직에 오늘의 MSC 표지자·면역조절·세포치료 개념을 소급해서 넣어서는 안 된다. 와튼의 직업·생몰년은 킹스 칼리지 런던의 인물 기록과 대조했다. 이 글에서 소장본은 명칭과 출판의 역사에 대한 사료이며, 원문의 모든 라틴어 문장을 번역·검증했다는 의미로 인용하지 않는다.^[2]

2003년 Mitchell 등의 연구는 WJ 기질에서 얻은 세포가 신경세포·교세포를 연상시키는 형태와 표지자를 보인다는 결과를 발표했다. 제목은 강하다. 하지만 연구사를 읽을 때 중요한 것은 제목의 확신을 이어받는 일이 아니라 당시 무엇을 신경분화의 증거로 삼았는지 보는 일이다. 배양 세포의 형태와 면역염색 신호, 실제 신경세포의 전기생리적 기능, 생체 내 회로 통합은 같은 수준의 증거가 아니다.^[9]

그 모양은 정말 신경분화 때문에 생긴 것일까. 이 질문을 놓고 읽을 자료가 이듬해 Lu 등의 골수 기질세포 연구다. 화학적 유도 뒤의 빠른 신경 유사 형태 변화가 독성·세포 수축·세포골격 변화로도 설명될 수 있음을 지적했다. 물론 골수 세포를 다룬 이 결과로 WJ를 사용한 Mitchell의 모든 결과를 반박할 수는 없다. 그러나 검증할 대안은 분명해진다. 신경세포로 분화해서 모양이 바뀐 경우와, 세포가 수축해 비슷한 모양이 된 경우를 무엇으로 구별할 것인가. 모양을 더 닮게 만드는 것만으로는 이 질문이 해결되지 않는다.^[10]

연표의 연도만 따라가면 발견에서 치료제로 곧장 발전한 역사처럼 보인다. 허나 문서가 답한 질문을 옆에 놓으면 다른 흐름이 드러난다. 조직을 기록한 뒤 세포를 배양했고, 배양한 세포에 이름을 붙이려 하자 무엇으로 확인할 것인지가 문제가 됐다. 그 확인을 거친 뒤에도 환자에게 어떤 효과가 있는지는 다시 시험해야 했다. 연구가 쌓인다는 것은 같은 주장을 더 크게 말하게 된다는 뜻만은 아니다. 앞서 하나로 불렀던 것을 더 정확히 나누게 되는 과정이기도 하다. 그 가운데 배양 세포의 공통 기준을 제시한 문서가 2006년 ISCT 입장문이다.

MSC의 최소 동정 기준과 줄기세포성

2006년 국제세포치료학회(International Society for Cellular Therapy, ISCT)가 제시한 최소 기준은 표준 배양 조건에서 플라스틱에 부착하고, CD105·CD73·CD90을 발현하며, CD45·CD34·CD14 또는 CD11b·CD79α 또는 CD19·HLA-DR을 발현하지 않고, 시험관에서 골·지방·연골 계열로 분화할 수 있다는 것이다. 면역표현형의 권고 기준은 양성 표지자 95% 이상, 음성 표지자 2% 이하다. 이는 배양한 사람 MSC를 비교하기 위한 최소 기준이며, 약효와 안전성을 모두 포함하는 완제품 출하 기준이 아니다.^[3]

표면항원을 확인하는 유세포분석은 세포 하나씩의 형광 신호를 측정한다. 그러나 죽은 세포·세포 조각·응집체를 어떻게 제외했는지, 항체와 보상 설정이 적절했는지, 양성의 경계를 어디에 두었는지에 따라 숫자의 의미가 달라진다. 서로 다른 장비에서 “CD90 양성”이라고 쓰였다는 것만으로 집단의 동등성을 보장할 수 없다. 최소 기준은 비교를 시작할 조건이지 비교가 끝났다는 표시가 아니다.^[3][21]

삼계열 분화시험에서는 관찰 지표도 계열에 맞춰 달라진다. Subramanian 연구는 지방분화 후 Oil Red O 염색으로 지질 축적을, 골분화 후 Von Kossa 염색으로 광물화된 침착을, 연골분화 후 Alcian Blue 염색으로 기질의 특성을 관찰했다. 이어 계열 관련 유전자 발현을 조사해 형태·염색·분자 자료를 대조했다. 한 검사에 모든 증명 책임을 맡기는 대신 서로 다른 관찰을 연결한 설계다. 여기서 염색은 분화 유도 조건에 대한 반응을 확인하는 도구이지, 그 세포를 환자에게 넣었을 때 완전한 뼈나 연골이 만들어진다는 임상시험이 아니다.^[1]

2019년 국제세포·유전자치료학회(International Society for Cell & Gene Therapy, ISCT)의 입장문은 조직 원천을 밝히고, 줄기세포성의 엄격한 근거가 없는 경우 stromal이라는 명칭을 쓰도록 권고한다. 여기서 자기재생은 단지 세포 수가 늘어나는 일과 구별된다. 증식 후에도 관련 능력이 유지돼야 하고, 다분화성 역시 집단을 서로 다른 배지에 나누어 넣었을 때 나온 결과인지 단일 세포의 후손에서 확인한 결과인지 따져야 한다. 집단 수준의 여러 분화 결과는 서로 다른 전구세포가 섞였을 때도 나올 수 있다.^[4]

그래서 이 글은 일반 설명에 중간엽기질세포라는 이름을 쓰고, 제품의 공식 성분명이나 논문 제목에 있는 중간엽줄기세포는 그대로 남긴다. 이름을 달리 적는 이유는 능력의 확인 범위를 드러내기 위해서다. 여기까지는 배양한 집단을 무엇으로 확인할지 살폈다. 그런데 검사 결과가 비슷한 두 집단이라면, 얻어낸 과정도 같은 것으로 보아도 될까. 다음에는 검사대에서 잠시 물러나 그 세포가 나온 조직과 배양 공정을 거슬러 올라가 보자.^[4]

채취 구획과 분리 공정이 만드는 세포 집단

실제 조직 분리 사진과 문헌 기반 공정도를 구분해 읽는다. 조직편 배양과 효소분해는 대표적인 두 경로이며, A 다음에 B를 수행한다는 뜻이 아니다.

채취 위치·제거한 조직을 기록한 WJ출발 재료의 구획을 먼저 확인

A · 조직편 배양조직편 부착 → 세포 유출·부착 → 배양 집단

B · 효소분해기질 분해 → 세포 현탁액 회수 → 부착·배양 집단

배양 후 별도로 확인MSC 동정 · 기능/역가 평가 · 임상 효과는 서로 다른 근거

제대의 채취 위치와 혈관 제거

실제 분리 사진 · 전체 도판 열기 ↗

Bharti 등, Cell and Tissue Research (2018), Figure 1. 원 논문 · Figure 1 · CC BY 4.0 · PMC 제공 도판 전체, 자르기·색상·내용 변경 없음. [15]

a · 길이 방향의 위치

Mother는 태반 쪽, Central은 중앙, Baby는 태아 쪽이다. 제대 단면의 해부 구획과는 다른 분류다.

b–e · 조직 준비

절단 조각(b)에서 혈관을 제거하는 장면(c), 제거한 혈관(d), 노출된 WJ(e)를 구분한다.

f · 조직편 부착

이 논문은 조직편 배양을 사용했다. 이 사진을 효소분해 경로의 실험 사진으로 제시하지 않는다.

이 육안 사진만으로 혈관주위·혈관사이 구획의 미세 경계나 제거 순도를 확정할 수 없다. 미세 해부 구획은 앞의 H&E 조직사진과 구분한다.

경로 A · 조직편 부착과 세포 유출

1. 조직편을 배양면에 부착위 Figure 1f는 이 단계의 실제 사진이다. 조직편 자체가 출발 재료로 남아 있다.
2. 조직편 밖으로 세포 유출·부착Bharti 등의 연구에서는 부착 약 1주 후 세포 유출을 관찰했다고 보고했다. 이는 해당 연구의 관찰 시점이지 모든 WJ 배양의 고정 시간이 아니다.
3. 조직편 제거 후 부착 세포 배양같은 연구에서는 10–12일에 조직편을 제거하고 남은 부착 세포를 배양했다. 얻는 집단은 유출·부착·생존·증식 조건을 거친 결과다.

근거: Bharti 등, Methods의 “Isolation and culture” 및 Figure 1. [15]

조직편 사진에는 세포 유출 과정이 직접 보이지 않는다. 위 시간 설명은 원문 관찰 기록이며, 사진을 시간 경과 영상처럼 재구성하지 않았다. 이후 계대배양에서 세포를 떼기 위한 효소 사용과, 처음 조직에서 세포를 분리하는 효소분해법은 구별해야 한다.

경로 B · 기질 분해와 세포 현탁액 회수

1. 조직의 세포외기질을 효소로 분해세포를 둘러싼 기질을 해체해 세포를 회수하는 경로다. 사용 효소와 조합은 연구마다 다르다.
2. 회수한 세포를 배양면에 접종회수 직후의 현탁액이 곧 순수한 MSC 집단이라는 뜻은 아니다. 분리와 이후 배양 선택을 나눠 봐야 한다.
3. 부착·배양 후 특성 평가회수 세포 수, 생존율, 증식과 특성은 동일한 지표가 아니다. 특정 조건의 수율 우위를 보편적 우월성으로 바꿀 수 없다.

Salehinejad 등의 비교 연구는 collagenase·hyaluronidase·trypsin 조합, collagenase·trypsin 조합, trypsin, 조직편 배양을 비교했다. 여기서는 공개 초록에서 확인되는 비교군과 결과 범위만 사용한다. [11] 단계 구분은 García-Muñoz·Vives의 조직 처리 방법 고찰을 따른다. [12]

문헌을 종합한 공정도이며 특정 제조사의 공정이나 단일 연구의 연속 촬영이 아니다. 효소 농도·시간·수율을 임의로 채우지 않았고, 실제 분리에는 변형·혼합 방식도 존재한다.

배양 형태·MSC 동정·역가의 구분

배양 형태

부착·증식과 방추형 형태를 관찰한다. 형태만으로 MSC를 확정하지 않는다. 실제 배양 현미경사진 보기

MSC 최소 동정 기준

ISCT 2006 기준: 표준 배양 조건의 플라스틱 부착, CD105·CD73·CD90 양성 ≥95%, CD45·CD34·CD14 또는 CD11b·CD79α 또는 CD19·HLA-DR 양성 ≤2%, 시험관 내 골·지방·연골 분화. [3]

기능·역가

동정 기준 충족만으로 특정 치료 기전에 필요한 활성을 보증하지 않는다. 목적에 맞는 기능 분석과 역가 평가가 별도로 필요하다. [21]

임상 효과

동정이나 시험관 내 기능 결과가 환자의 치료효과를 대신하지 않는다. 대상 질환·제품·투여 조건에 맞는 임상 근거를 별도로 읽는다.

분리 경로가 다르거나 같은 WJ에서 유래했다는 사실만으로 두 배양 집단의 동일성·치료적 동등성이 성립하지 않는다.

위 공정도는 문헌에 따른 단계·재료 상태의 비교다. 임의의 세포 모양·개수·운동이나 가상의 실측값은 사용하지 않았다. 실험 수행용 SOP가 아니다.

분리 공정은 제대를 확보한 순간부터 시작된다. 공여 동의, 조직의 식별, 채취와 처리 사이 시간, 운송 조건, 혈관과 양막의 제거 범위가 출발 재료를 규정한다. 비교 연구에서는 같은 공여자의 조직을 나누어 서로 다른 방법을 적용하는 설계가 유용하다. 서로 다른 공여자에게 서로 다른 방법을 적용하면 공여자 효과와 공정 효과가 뒤섞인다.^[11][12]

조직편 배양(explant culture)은 작은 조직을 배양면에 두고 밖으로 이동해 부착·증식하는 세포를 얻는다. 효소분해는 콜라겐분해효소·히알루론산분해효소 등의 조합으로 기질을 풀어 세포를 회수한다. 2012년 비교 연구는 세 종류의 효소 접근과 조직편 배양을 대조했다. 효소를 쓰지 않았다는 사실이 손상이 전혀 없음을 뜻하지 않고, 효소를 썼다는 사실도 열등함을 뜻하지 않는다. 회수율·생존율·증식·분화·재현성이라는 서로 다른 결과를 함께 비교해야 한다.^[11]

조직편에서 빨리 빠져나오는 세포와 원래 조직에 많이 존재하는 세포는 동일한 집단일 필요가 없다. 배양에서 빨리 증식하는 세포와 원하는 면역조절 기능이 큰 세포도 반드시 일치하지 않는다. 출발 조직에 있던 다양성이 분리·부착·증식 과정에서 선택되는 것이다. 그러므로 “조직 안에서 줄기세포를 발견했다”는 문장에는 발견과 선택이 함께 들어 있다. 배양이 새로운 생명체를 무에서 만든다는 의미는 아니지만, 관찰할 집단의 구성을 바꿀 수 있다.^[13][14]

가령 두 실험실이 모두 조직편 배양을 했는데 결과가 달랐다고 하자. 방법 이름만 같으면 어느 쪽이 잘못했는지부터 묻게 된다. 그러나 한쪽은 다른 구획을 남겼고 배지와 회수 시점도 달랐다면, 애초에 같은 조건을 비교한 것이 아니다. 위 표는 그 차이를 되짚기 위한 기록이다. 출발 조직에서 배양 집단까지 무엇이 같고 무엇이 달랐는지 맞춰본 뒤에야 공정의 차이를 논할 수 있다. 그렇다면 조건을 맞춰 얻은 한 배양 집단 안에서는 모든 세포가 같을까. 이 질문은 집단을 통째로 보는 검사에서 세포 하나씩을 보는 분석으로 이어진다.^[12]

공여자·위치·배양 단계에 따른 이질성

출판사 원본 확대 ↗

Subramanian·Fong·Biswas·Bongso, PLOS ONE (2015), Figure 2. 원 논문 · CC BY 4.0 · 원본 비율 유지, 이미지 내용 변경 없음.

A · WJ

와튼젤리에서 유래한 배양 집단.

B–D · PV / SA / AM

각각 혈관주위·양막 아래·양막에서 유래한 집단.

E · MC

혼합 제대 배양. a–b와 c–d의 서로 다른 형태를 비교한다.

이 연구 조건에서 촬영한 형태 비교다. 다른 구획·배율의 사진을 동일 세포의 시간 경과로 읽거나, 모양만으로 줄기세포성·치료 우열을 판정하지 않는다. 근거 [1].

같은 MSC 항원 조합을 공유한다는 답만으로는 부족하다. 2020년 단일세포 RNA 연구는 세 공여자에서 배양한 WJ-MSC 6,878개를 분석해, 집단 평균에 가려지는 세포주기·기질·신호 관련 차이를 조사했다. CD142로 구분한 세포들의 기능도 비교했다. 여기서 분석 단위가 바뀐 것을 눈여겨보자. 6,878개의 세포를 본 덕분에 집단 내부를 세밀하게 살필 수 있지만, 공여자는 여전히 세 명이다. 세포를 더 많이 읽으면 한 집단의 내부는 선명해진다. 그렇다고 사람 사이의 차이까지 같은 비율로 더 잘 알게 되는 것은 아니다.^[13]

2023년 Chen 등의 연구는 단일세포와 공간 전사체를 연결해 증식·미세환경 지원·대사·생물학적 기능과 관련된 하위집단을 기술했다. 특정 표지 조합을 가진 집단은 상처 회복 실험에서 관심을 끌었고 제대의 태아 쪽에 상대적으로 풍부했다. 그러나 군집 이름은 분석법과 자료에 의존하는 연구상의 분류다. 해당 집단을 모든 실험실에서 동일하게 분리할 수 있는지, 사람의 상처 치료에서 이점이 재현되는지는 후속 검증 대상이다.^[14]

제대의 길이 방향도 변수다. 같은 제대의 서로 다른 부분에서 얻은 세포를 비교한 2018년 연구는 “공여자가 같음”만으로 위치 차이가 사라지지 않는다는 질문을 제공한다. 모체·신생아 변수를 다룬 2024년 연구는 세포 수율과 출생체중·재태연령의 관련성을 보고했다. 관련성은 제조에 참고할 정보이지만 특정 조건의 공여자가 임상적으로 더 우수하다는 결론까지 직접 제공하지 않는다.^[15][16]

임신성 당뇨 공여자에서 얻은 제대 MSC의 내피 장벽 관련 기능을 조사한 연구도 있다. 이는 젊은 조직이라는 설명 안에 모체의 대사 환경이라는 차이가 숨어 있음을 보여준다. 그렇다고 해당 공여자의 모든 세포가 치료에 부적합하다는 결론을 낼 수는 없다. 연구가 측정한 기능과 완제품의 적합성을 판정하는 기준은 구분해야 한다.^[17]

차이가 이렇게 많다면 모두 없애야 좋은 제품이 되는 것일까. 꼭 그렇지는 않다. 여러 하위집단의 상호작용이 원하는 기능에 기여할 가능성도 있기 때문이다. 중요한 것은 어떤 차이가 목표한 기능을 바꾸며 그 변화를 어느 범위까지 허용할 수 있는가다. 이때부터 표지자를 얼마나 고르게 발현하는지와 별개로, 실제 기능을 연결해 보는 시험이 필요해진다. 그리고 확인을 마친 집단도 계속 같은 상태에 머무르지는 않는다. 공급할 만큼 증식시키고 보관하려면 배양과 동결이라는 조건을 더 통과해야 한다.^[21]

계대 배양·세포 노화·동결 후 회복

계대(passaging)는 배양면이 채워진 세포를 떼어 새 용기에 나누는 과정이다. P3라는 표시는 세 번 계대했다는 이력이지 세포가 세 번만 분열했다는 뜻이 아니다. 접종 수와 회수 수를 함께 기록하면 집단 배가 수를 log₂(회수 세포 수/접종 세포 수)로 계산할 수 있다. 예를 들어 100만 개를 넣고 800만 개를 회수한 한 배양 구간은 집단 수준에서 세 번의 배가에 해당한다. 이는 계산 예시이며 특정 WJ 제품의 제조 수치가 아니다.

장기 배양에서 세포는 증식률·형태·유전자 발현과 분화 잠재력을 바꿀 수 있다. Wagner 등의 2008년 연구는 MSC의 복제노화를 연속적인 과정으로 다뤘다. 세포 노화는 어느 날 갑자기 켜지는 단일 스위치로만 설명하기 어렵고, 계대 번호 하나가 모든 배양의 생물학적 나이를 같게 만들어 주지도 않는다. 이런 연구는 골수 등 다른 원천을 포함하므로 WJ-MSC의 개별 제조 한계를 수치로 정하는 데 그대로 사용해서는 안 된다.^[18]

WJ 추출물을 배양 표면에 사용한 2013년 연구는 산화스트레스와 p53·p16INK4a/pRb 관련 변화를 측정하며 배양 중 노화 지연을 조사했다. 이 결과는 기질 환경이 세포의 상태에 관여한다는 실험실 근거다. 같은 추출물을 사람에게 주사하면 노화가 역전된다는 임상적 증거는 아니다. “세포 배양에서 노화 지표가 변했다”는 문장의 주어와 장소를 끝까지 보존해야 한다.^[19]

동결은 공급을 가능하게 하지만 세포가 통과하는 또 하나의 환경 변화다. 2015년 WJ-MSC 동결보호제 비교 연구는 해동 직후뿐 아니라 이후의 생존과 증식, 세포사멸 관련 발현을 살폈다. 10% 디메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide, DMSO; 동결 손상을 줄이기 위한 보호제) 조건의 해동 직후 생존율은 약 81%였지만, 이를 모든 제품의 표준 생존율로 사용하면 안 된다. 실험에 사용한 세포·보호제·동결 속도·평가 시점의 결과이기 때문이다.^[20]

총세포 1억 개, 생존율 80%인 가상의 용기를 생각해 보자. 계산하면 살아 있는 세포는 약 8천만 개다. 여기까지는 셈이 된다. 그런데 “그러면 효과도 80%인가”라고 물으면 계산이 멈춘다. 생존율의 분모는 세포 수였지 치료 효과가 아니기 때문이다. 더구나 그 80%를 해동 직후에 측정했는지, 회복 배양 후인지, 실제 투여 직전인지에 따라 우리가 확인한 상태도 달라진다. 이제 물어야 할 것은 그 수의 세포가 어떤 조건에서 어떤 일을 하는가다. 다음의 면역조절 연구들은 바로 그 기능을 다룬다.^[52]

염증 신호에 대한 반응과 숙주 면역세포의 변화

MSC 치료의 기전은 투여한 세포가 손상된 조직의 세포로 바뀌어 빈자리를 채운다는 설명으로 끝나지 않는다. 연구에서는 분비인자, 세포 간 접촉, 숙주 면역세포의 변화가 함께 조사된다. Weiss 등의 2008년 WJ 유래 세포 연구는 자극된 림프구의 증식 억제와 낮은 면역자극성을 시험했다. 이는 시험관에서 관찰된 면역학적 성질이며, 모든 환자에서 거부반응이 없거나 모든 염증질환에 유효하다는 결론을 뜻하지 않는다.^[22]

면역조절의 유도: licensing

Licensing은 염증성 신호가 MSC의 면역조절 기능을 유도하거나 바꾸는 현상을 설명하는 말이다. WJ 기질세포를 대상으로 한 2010년 연구는 림프구의 활성화 상태와 MSC를 넣는 시점에 따라 억제 효과가 달라지는지 조사했다. 세포가 언제나 일정량의 항염증 물질을 내놓는 고정된 주머니라면 이런 조건 차이가 중요하지 않을 것이다. 그러나 실제 작용은 세포가 놓이는 환경과 상대 세포의 상태에 의존할 수 있다.^[23]

인돌아민 2,3-이산소화효소(indoleamine 2,3-dioxygenase, IDO)는 트립토판 대사에 관여하는 효소다. 소아 혈액·종양 및 면역 분야 연구자 Roland Meisel 등의 2004년 사람 골수 기질세포 연구는 인터페론 감마(interferon gamma, IFN-γ; 면역 반응을 조절하는 사이토카인)에 의해 유도되는 IDO와 트립토판 분해가 T세포 반응 억제에 관여함을 조사했다. 여기서 골수 연구는 MSC 기전의 배경 근거로 인용한다. 이 경로의 존재만으로 특정 WJ 제품의 역가를 입증하지 않으며, 제품별 발현·활성과 실제 기능시험이 필요하다.^[24]

이름을 잠시 걷어내고 실험의 순서를 보자. IFN-γ가 세포에 작용하고, 효소 활성이 주변의 트립토판 대사 환경을 바꾸며, 그 환경에 놓인 T세포의 증식 반응이 달라진다는 설명이다. 효소의 발현과 증식 억제가 함께 관찰됐다는 것만으로 이 연결이 완성될까. 두 현상이 다른 이유로 함께 나타났을 가능성이 남는다. 그래서 Meisel 등은 혼합 림프구 반응에 트립토판을 보충했을 때 억제가 회복되는지도 조사했다. 제안한 설명에서 중요한 조건을 다시 바꾸어본 것이다. “IDO가 관여한다”는 한 줄 안에는 분자를 검출하는 일뿐 아니라 그 연결을 시험하는 이 단계가 들어 있다.^[24]

프로스타글란딘 E2(prostaglandin E2, PGE2; 세포 사이 신호 전달에 관여하는 지질 매개물질)도 단순한 “좋은 항염증 물질”로 외울 수 없다. 2010년 원천 비교 연구는 지방·WJ·골수 MSC와 림프구의 상호작용에서 PGE2의 역할을 조사했다. Krisztián Németh 등이 수행한 2009년 면역조절 연구는 생쥐 패혈증 모형에서 골수 기질세포가 숙주 대식세포의 인터루킨 10(interleukin-10, IL-10; 면역 반응을 조절하는 사이토카인) 생산을 바꾸는 경로를 시험했다. 서로 다른 모형에서 나온 결과를 연결하면 가설을 세울 수 있지만, 사람의 WJ 세포주사 한 번이 동일한 연쇄를 재현한다는 증거는 별도로 확보해야 한다.^[25][26]

세포가 사라진 뒤의 작용

Galleu 등의 2017년 연구는 이식편대숙주병 모형과 환자 자료를 통해 투여 MSC의 세포사멸과 숙주의 포식 반응이 면역조절에 관여할 수 있음을 보였다. 주입 세포가 오래 생착해야만 모든 효과가 가능한 것은 아니라는 중요한 기전적 전환이다. 그러나 이 결과에서 “죽은 세포 제품도 살아 있는 MSC 제품과 같다”를 끌어내면 실험의 인과를 바꾼다. 살아 있는 세포가 특정 환경에서 사멸하며 숙주와 상호작용하는 과정과 미리 가공된 잔해를 투여하는 과정은 다르다.^[27]

처음의 질문으로 돌아가면 설명이 달라진다. 투여한 세포가 오래 남아 새 조직이 되어야만 작용할 수 있다고 생각했다면, 세포가 사라진다는 관찰은 곧 실패처럼 보였을 것이다. 그러나 숙주와의 상호작용을 통해 작용할 수 있다면 어디에서, 언제, 누구와 반응했는지를 더 살펴야 한다. 물론 이 설명으로 효과가 없었던 모든 임상시험을 구제할 수는 없다. 상호작용이 중요하다는 가설이라면 그 반응이 실제로 일어났는지부터 확인해야 하기 때문이다. 그래서 다음 질문은 투여 경로다. 배양접시에서 기능을 보인 세포를 몸에 넣었을 때, 그 세포는 실제로 무엇과 만나게 될까.

투여 경로·혈액 적합성·추적관찰

정맥으로 들어간 세포는 약물 분자처럼 균일하게 전신에 확산하지 않는다. Fischer 등의 연구는 정맥 투여 세포가 폐를 통과하는 과정의 제한, 이른바 폐 초회통과 효과를 조사했다. 세포 크기·부착·혈관계와의 상호작용을 고려해야 한다. 이 연구를 근거로 모든 WJ-MSC가 반드시 폐에 갇힌다고 정량화해서도 안 되지만, 정맥 투여를 곧 표적 장기 도달로 간주할 수도 없다.^[28]

관절강 내 주사, 정맥 주입, 조직 결손 부위의 수술적 이식은 전달 조건이 다르다. 관절에서는 국소 염증과 관절액, 기계적 하중이 문제가 되고, 정맥에서는 혈액 접촉과 분포가 중요하며, 이식에서는 지지체와 조직 결합이 작용한다. 같은 수의 세포를 다른 경로로 넣었다고 동일한 생물학적 노출이 생기는 것은 아니다. 투여량을 세포/kg로 보고한 논문과 결손 면적당 세포 수로 보고한 제품을 한 줄의 고용량·저용량 순위로 배열할 수 없는 이유다.^[36][52]

Moll 등의 2012년 연구는 MSC의 혈액 적합성을 시험하며 응고와 염증이 빠르게 연결되는 반응을 다뤘다. 조직인자 등 혈액 응고에 영향을 미치는 표면 성질이 중요하다. 최소 MSC 표지자를 충족했다는 사실이 혈액 접촉 안전성까지 증명해 주지 않는다. 다만 이런 실험적 위험 기전이 모든 임상 투여에서 혈전이 발생한다는 뜻은 아니므로, 기전과 실제 이상사건 발생률을 분리해 서술해야 한다.^[29]

RYONCIL의 처방정보에는 주입 반응과 감염원 전파, 이소성 조직 형성 등에 관한 경고가 명시돼 있다. 이것은 특정 허가 제품의 문서이며 WJ 제품 전체의 부작용 목록을 대신하지 않는다. 다만 허가가 위험의 부재를 뜻하지 않고, 어떤 위험을 어떤 체계로 관리할지까지 포함한다는 사실을 보여준다. 안전한가라는 질문은 적응증·투여 경로·기간·비교 치료를 포함할 때 구체적인 답을 가질 수 있다.^[42]

그렇다면 작은 시험에서 심각한 이상반응이 없었다는 결과는 어떻게 읽을까. 우선 그 시험에서 관찰하지 못했다는 사실은 남는다. 다만 드문 사건을 볼 만큼 사람이 많았는지, 늦게 생기는 사건을 볼 만큼 오래 추적했는지는 또 다른 문제다. “없었다”는 말을 의심부터 할 필요는 없다. 그 말이 포괄하는 사람과 기간을 붙이면 된다. 그렇게 범위를 맞춘 다음에야 다른 시험과 안전성 자료를 함께 읽을 수 있다.^[45]

살아 있는 세포와 세포 유래 제제의 구별

앞에서는 세포 자체뿐 아니라 세포가 내놓는 물질과 숙주의 반응도 작용에 관여할 수 있음을 보았다. 그렇다면 세포 대신 그 물질을 얻어 사용하면 어떨까. 여기서 분비체와 세포외소포 연구가 앞의 기전 설명과 만난다. 다만 무엇을 따로 얻었는지에 따라 시험 대상이 바뀐다. 살아 있는 세포에 관한 결과를 옮기기 전에, 분리한 물질의 정체부터 다시 확인할 이유가 생긴 것이다.

세포를 배양한 뒤 얻은 상층액에는 세포가 내놓은 가용성 물질과 세포외소포뿐 아니라 배지에서 온 성분도 포함될 수 있다. 배양액, 조건배지(conditioned medium; 세포를 배양하며 그 세포의 영향을 받은 배지), 분비체(secretome; 세포가 분비하는 물질의 총체), 정제한 EV는 동의어가 아니다. 분비체라는 포괄적 표현을 쓸 때도 실제로 무엇을 분리했는지 밝혀야 한다. 작용이 소포 때문인지 가용성 단백질 때문인지 알려면 분획과 적절한 대조가 필요하다.^[30]

MISEV2023(Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles 2023; 세포외소포 연구의 최소 보고 정보 권고)은 세포외소포 연구에서 기원·분리·특성 분석·기능시험의 보고를 다룬다. 작은 입자가 검출됐다는 사실만으로 엔도솜 기원의 엑소좀이라고 확정할 수 없다. 입자의 크기와 수를 측정하는 장비는 그 입자가 모두 원하는 소포인지, 오염 단백질이나 다른 입자가 얼마나 섞였는지까지 자동으로 알려 주지 않는다. 특정 막단백질 몇 개의 검출 역시 기능의 증명과 구별된다.^[30]

기질 제품도 같은 검증을 거친다. Marleau 등의 2026년 연구는 문헌 검토와 일부 최소 가공 WJ 제품의 분석을 함께 제시했다. 검사 표본에서는 생존율이 0–19.1%였고 살아 있는 MSC가 드물었다. 이를 모든 제조사의 모든 제품을 검사한 결과로 일반화할 수는 없다. 또한 논문이 제시하는 MSC 용량 범위를 전 질환의 보편적 최소 유효량으로 바꾸어서는 안 된다. 이 자료의 직접적인 가치는 “WJ라고 쓰인 용기에 실제로 무엇이 들어 있는가”를 측정 대상으로 삼았다는 점이다.^[31]

여기서 “살아 있는 MSC가 드물었다니 와튼젤리는 허구였군”이라고 결론 내리면, 처음에 나눠놓은 대상을 다시 섞게 된다. 기질이나 EV를 이용하는 연구는 살아 있는 세포를 투여하는 연구와 다른 질문을 가질 수 있다. 반대로 “기질에도 가능성이 있다”는 설명으로 살아 있는 MSC의 효과를 광고할 수 있는 것도 아니다. 어느 쪽이든 용기 안의 물질과 시험에 사용한 물질이 맞아야 한다. 이 연결을 확인했다면 이제 다음 질문으로 갈 수 있다. 그 물질을 환자에게 투여했을 때, 무엇과 비교해 어떤 차이가 생겼는가.

임상시험의 비교·평가지표·불확실성

주사를 맞은 뒤 통증이 줄었다고 해보자. 환자에게는 반가운 변화다. 그런데 그 변화 가운데 얼마를 주사의 효과라고 부를 수 있을까. 비교군에서도 비슷하게 좋아졌다면 투여 전후의 차이 전체를 세포 덕분으로 돌리기는 어렵다. 그래서 임상시험에는 대상자와 중재뿐 아니라 비교군, 측정한 결과, 관찰 기간이 함께 필요하다. 같은 무릎 골관절염이라도 질환 정도·동반 손상·기존 치료가 다르고, 세포의 원천·배양·용량·횟수·경로가 다르면 시험한 중재도 달라진다. 비교군이 생리식염수인지 히알루론산인지 수술인지에 따라 “무엇보다 나았는가”의 답도 바뀐다.^[45]

통증 점수, 기능 점수, 자기공명영상(magnetic resonance imaging, MRI)상 구조, 조직검사, 수술 회피, 삶의 질은 서로 관련돼 있지만 대체 가능한 결과가 아니다. 통증이 줄어드는 일은 환자에게 실질적인 가치가 있다. 그러나 통증의 개선을 연골이 재생됐다는 말로 바꾸려면 구조적 근거가 더 필요하다. 반대로 영상의 작은 변화가 임상적으로 의미 있는 통증·기능 개선으로 이어지는지도 확인해야 한다. 시험의 장점을 부풀리는 것과 환자가 느끼는 개선을 가볍게 보는 것은 모두 자료를 벗어난다.

무작위배정은 출발 집단의 차이를 줄이기 위한 장치이고 눈가림은 기대와 평가의 영향을 줄이는 장치다. 무작위시험이라는 이름이 붙었다고 모든 편향이 사라지지는 않는다. 배정 은폐, 중재 이탈, 결과 누락, 결과 측정, 선택적 보고를 따로 검토해야 한다. Cochrane의 RoB 2 체계는 이러한 영역을 구분한다. 이 글은 정식 RoB 2 점수를 산출하지 않고, 각 사례에서 해석에 중요한 설계상의 제약을 설명한다.^[45]

단일군 관찰연구는 실제 사용 환경과 장기 경과를 보여줄 수 있다. 다만 치료를 선택한 사람의 특성, 함께 받은 시술, 자연 경과, 추적에서 빠진 사람의 차이 때문에 인과효과를 분리하기 어렵다. 비무작위연구의 가치와 한계를 함께 적어야 한다. 논문의 수를 세는 대신 어떤 질문에 어떤 설계의 자료가 필요한지 대응시키는 것이 문헌 고찰의 기본 작업이다.^[46]

앞부분에서 구획과 배양, 생존율을 오래 살핀 이유가 여기에 있다. 논문에 적힌 세포 이름만으로는 무엇을 넣었는지 알 수 없고, 용량만으로는 어떤 상태의 세포였는지 알 수 없다. 이제 여기에 대조군과 결과를 포개어 볼 차례다. 아래 무릎 시험에서는 통증에 관한 결과와 MRI 결과가 같은 방향으로 정리되지 않는다. 그렇다면 무엇이 좋아졌고, 무엇은 아직 확인되지 않은 것일까.